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改善反相HPLC中的峰拖尾
在反相HPLC中峰拖尾是一个普遍的现象。特别是分离碱性化合物和通过HPLC分析药物成分时是经常产生拖尾缘由。但是用V型混合机是最好的办法，峰拖尾可以引起分离度降低，灵敏度减弱，精密度和定量变差。图1表明峰之间的分离度和灵敏度与峰拖尾成负相关。图2表明准确度和精密度因数据系统无法准确识别峰的起点和终点而受到影响。
图1 拖尾对分离度和灵敏度的影响
当峰拖尾（T，拖尾因子）从1.0增加到2.0时，分离度（Rs）从1.5降到1.0。灵敏度（峰高）由于峰的体积增大和样品的浓度降低而降低。
图2 峰拖尾对准确度和精密度的不利影响。
拖尾峰使数据系统难以准确确定峰的终点，故而影响准确度和精密度。在这个例子中，在B点测得到峰面积比在A点测得的峰面积少约3%。
峰拖尾的原因，峰拖尾的主要原因有：
1、 溶解样品的溶剂比流动像更强，
2、 样品量过载，
3、 固定相中的硅醇基与胺类物质相结合反应，
4、 硅胶吸附酸性化合物，
5、 色谱柱柱床中有空隙。
只要确定了拖尾的原因就可以采取措施减少拖尾并消除之。（表1）
表1 峰拖尾：原因及解决方案
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原因
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解决方案
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样品溶剂极性强于流动相
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在流动相中溶解样品，尽可能降低样品溶剂的强度
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样品量过载
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减少进样量，参考表2中推荐的不同柱型对应的不同进样体积
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硅醇基与胺类物质的结合
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1.调节流动相的pH<3.0。
2.增加流动相的离子强度，25mM～50mM。
3.流动相中增加竞争性的胺类，10mM的TEA（三乙胺）。
4.选择低硅醇活性的固定相。参照图6 C18柱按固定相硅醇活性分级。
5.
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酸性物质在硅胶上的吸附
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1. 增加流动相中盐的浓度，25mM～50mM。
2. 调节流动相的pH<3.0
3. 增加竞争性的有机酸，1%醋酸或者是0.1%TFA（三氟乙酸）
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柱子空隙
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更换新的色谱柱
尝试填充空隙很少能达到较好的效果。
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一、由于溶解样品的溶剂极性强于流动相而引起的拖尾
如果溶解样品的溶剂极性强于流动相，就会引起宽的甚至是拖尾的峰。有几种线索可以帮助确定是由于此种原因引起的拖尾。第一种就是先流出的峰的拖尾较后流出的峰拖尾严重；另一种迹象就是进样量减少或者是样品经流动相稀释后进样峰拖尾减轻了。
如果怀疑拖尾的原因是流动相的强度引起的，解决很简单。将样品溶解在流动相中，或者将样品经流动相稀释至进样后峰拖尾符合要求。
二、由样品量过载引起的峰拖尾
当进样量超过柱子的容量，样品峰会呈现一个直角三角形。当更多的样品量注入时，峰的前端变得很尖而后端就拖尾更严重。另一个现象就是色谱柱过载后保留时间会随样品量的增加而提前。（见图3）由样品过载引起的峰拖尾的解决方案就是减少进样量。表2提供了各色谱柱的直径及参考的最大进样量，表2还提供了进样量的范围，因为实际进样量依赖于柱子的填料（具有高的表面积的填充材料可以具有大的进样量），分析物质（分子量大的进样量要少），和其他的因素比如样品在流动相中的溶解性。
图3 样品量过载引起的拖尾
样品过载，峰的前端会变得尖锐，后端拖尾，保留时间会稍微提前。如果峰形看上去有点像直角三角形，那么可能就是过载了。
表2 HPLC色谱柱的参考最大进样量
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柱直径（mm）ID
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参考最大样品量（mg）
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10
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35-65
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4.6
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4.5-9.0
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3.0
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2.0-4.0
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表3 反相HPLC常用缓冲液
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缓冲液
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pKa
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缓冲液范围
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UV截止波长（nm）
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磷酸盐
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2.1
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1.1～3.1
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200
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7.2
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6.2～8.2
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12.3
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11.3～13.3
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醋酸盐
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4.8
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3.8～5.8
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210
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柠檬酸盐
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3.1
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2.1～4.1
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230
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4.7
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3.7～5.7
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5.4
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4.4～6.4
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Tris（三羟甲基氨基甲烷）
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8.3
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7.3～9.3
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205
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三乙胺
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11.0
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10.0～12.0
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200
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三、由固定相中的硅醇基与胺类相互作用引起的拖尾
在反相HPLC中出现拖尾的另一个常见的原因是由于带正电荷的溶液（胺类）与固定相颗粒表面上的酸性硅醇发生了离子交换而引起的二次保留(图 4)，具有显著的硅醇活性的固定相的色谱柱大部分都会发生此现象，而且中性pH（6～8）条件下比在酸性pH（<3）更易发生。
酸性和中性的化合物一般不受影响，一些碱性化合物更易受到此效应的影响。如果是因为硅醇的原因引起的拖尾，可以从下面几部来纠正拖尾的问题。首先，确认流动相中有合适的缓冲盐，可能的话尽量在pH<3的条件下操作。使用足够的缓冲液控制pH并减少离子交换效应。
在pH<3的条件下操作，可使硅胶固定相上的硅醇基质子化，减少了溶质与硅醇反应的几率。
图4相互作用引起的峰拖尾
固定相表面的酸性硅醇基可以形成与碱性化合物反应的离子交换位点，经反相HPLC分离胺类化合物时，这种离子交换反应常常引起峰的保留（二次保留）和峰拖尾。
另一种解决拖尾的方法是在流动相中加入竞争性的胺类，加到流动相中的三乙胺（TEA）就是这个目的。TEA可以与硅醇发生强的反应，并抑制样品中的胺类与硅醇反应。图5是TEA如何提高峰形的例子，多数情况下，大约10mM的TEA足够了。
有些色谱分析者反对向流动相中加入竞争性的胺类，因为增加了分析方法的复杂性并且用一种不易逆转的方法改变了色谱柱的性质。强度胺类，像三乙胺，不易从色谱柱上洗脱下来。那意味着用过含有TEA的色谱柱就不再适合应用于流动相中不含TEA的分析。
图5 向流动相中加入TEA用来提高峰形
色谱柱：Eclipse XDB-C8 4.6*150mm
流动相：85%25mMNa2HPO4，pH7.0，15%ACN
流速：1.0ml/min
温度：35℃
样品：苯丙胺类
1. 苯丙醇胺
2. 麻黄碱
3. 苯丙胺
4. 甲基苯丙胺
5. 苯三胺
向流动相中加入竞争性的胺类，三乙胺等，可以减少峰拖尾。三乙胺与硅醇强烈作用，减少了样品混合物中胺类与硅醇的作用。阿米替林常用来检测反相HPLC色谱柱的硅醇活性。下表根据阿米替林的对称性（峰拖尾）对色谱柱进行了分类。其中阿米替林具有较低的对称性的柱子具有较低的硅醇活性，这些色谱柱是常常用来用反相HPLC分离胺类物质的最好选择。数据来源于国家标准化研究所对标准参考物质的分析认证870“液相色谱用柱性能测试混合物”
使用三乙胺可以不用选择低硅醇活性的固定相。图6根据硅醇的活性分列出了常用的C18反相色谱柱，在图6中的分类根据测定阿米替林的对称性，一种胺类常用来测定固定相的硅醇活性。阿米替林在固定相中具有较低拖尾（低对称值）时，该固定相就显示较低的硅醇活性并且检测碱性化合物时就会有较低的拖尾。
图6 根据硅醇活性排列的常用C18柱
色谱柱：4.6×150mm，5um
流动相：80%甲醇20%0.05M磷酸盐缓冲液pH7
流速：2.0ml/min
温度：24℃
样品：阿米替林
四、酸性化合物在硅胶上吸附引起的拖尾
虽然较胺类引起的拖尾少，酸类物质有时候引起峰的展宽和拖尾主要由于硅胶固定相的吸附。纠正因为此类原因引起的拖尾就应提高流动相中盐的浓度来抑制二次反应，降低流动相的pH使硅醇和溶质质子化，必要时可以向流动相中加入竞争性的酸（图7）。
图7 酸性化合物引起的峰拖尾通常可以向流动相中加入酸来改善
色谱柱：4.6×150mm，C18
流动相：40%5mMNaH2PO460ACN
样品：布洛芬
布洛芬，酸性化合物，严重拖尾，向流动相中加入乙酸可以改善。乙酸优先和硅胶固定相表面的酸性硅醇基反应，抑制了布洛芬和硅醇基的反应，减低了拖尾。
五、由于柱床空隙引起的拖尾
色谱柱床的柱头空隙可引起峰的展宽有时候会拖尾。虽然几年前柱子有空隙非常普遍，生产商现在完善了填装技术生产更高质量的色谱柱，除非在极高的压力或流速的条件下装柱，很少色谱柱中有空隙，然而，如果通常色谱柱具有良好的柱效，突然发现所有的峰均拖尾时，可能是柱子有空隙。先洗脱出的峰较后洗脱的峰更易受柱空隙的影响。
虽然许多色谱分析者尝试用相同的固定相材料修补柱子的空隙，就经验来讲，此法很少能达到预期的效果。由于柱子空隙引起的拖尾最好的解决方法就是换掉它，这样可以节省时间，金钱，减少麻烦。
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